Zamana meydan okuyan yöntem: Jaffe Reaksiyonu

Jaffe_Reaction

Böbrek yetmezliğinin teşhisi, aşamasının belirlenmesi, tedavi takibi ve prognozun değerlendirilmesi gibi amaçlarla kan kreatinin konsantrasyonu ölçülmektedir.

Bunun yanında zaman zaman idrar kreatinin konsantrasyonu tek başına veya başka test parametreleri ile birlikte (protein gibi) ölçülmekte ve değerlendirilmektedir. Bu ölçümleri yapmanın yegâne yolu belirli analitik yöntemlerin kullanılmasıdır. Sıklıkla kullanılan yöntemlerden biri Jaffe reaksiyonudur. Kolorimetrik bir yöntem olan Jaffe reaksiyonu ile kan ve idrar örneklerinden kreatinin konsantrasyonu belirlenmektedir1.

Max Jaffe

Bundan 132 sene önce (1886) Max Jaffe (1841-1911) alkali ortamda kreatininin pikrik asitle reaksiyona girdiğini keşfetmiş ve bunu “Über den Niederschlag, welchen Pikrinsäure in normalem Harn erzeugt und über eine neue Reaction des Kreatinins” isimli makalesini yayınlayarak açıklamıştır2. Makalede, bu reaksiyon ve oluşan çökeltinin doğası anlatılmıştır. Jaffe’ nin bu keşfi bir dönüm noktası olmuştur. Bu çalışma neticesinde son derece popüler hale gelen ve zamana karşı meydan okuyan kreatinin konsantrasyonu ölçme yöntemi doğmuştur.

Zamanla, Jaffe’nin adı klinik kreatinin testiyle eş anlamlı hale gelmesine rağmen, makalesi daha sonra kalıcı yöntem haline gelmiş ve yapılacak çalışmaların ilkesi olmuştur. Yirminci yüzyılın başlarında Otto Folin (1867-1934), Max Jaffe’ nin araştırmasını ele alarak kan ve idrarda kreatinin konsantrasyonunun ölçülmesi için kolorimetrik bir yöntem geliştirmiş3 ve modern biyokimya analizleri arasına girmesini sağlamıştır.

Günümüzde daha spesifik analitik yöntemlerin4 olmasına karşın, Jaffe reaksiyonunun uygulanma basitliği, hızı, otomatik analizörlere uyumu ve maliyetinin daha uygun olmasıyla bu eşsiz test hâlâ tercih edilen yöntem olarak kullanılmaktadır. Bunun yanında Jaffe reaksiyonu klinik laboratuvarlarda kullandığı en eski test yöntemidir.

Kaynaklar
1.Delanghe JR, Speeckaert MM. Creatinine determination according to Jaffe – What does it stand for? NDT Plus. 2011;4(2):83-86. doi:10.1093/ndtplus/sfq211. 
2. Jaffe M. Ueber den Niederschlag, welchen Pikrinsäure in normalem Harn erzeugt und über eine neue Reaction des Kreatinins. ZPhysiolChem. 1886. doi:10.1515/BCHM1.1886.10.5.391.
3. Folin O. Beitrag zur Chemie des Kreatinins und Kreatins im Harne. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1904. doi:10.1515/bchm2.1904.41.3.223.
4. Panteghini M, IFCC. Enzymatic assays for creatinine: Time for action. Scand J Clin Lab Invest. 2008;46(4):567-572. doi:10.1080/00365510802149978.

Biyokimya.vet ekibinden Dr. öğrencisi Veteriner Hekim Sevgi Gençosman “Araştırmada ve Tıbbi Uygulamada Kullanılan Moleküler Laboratuvar Teknikleri” kursuna katıldı.

Son yıllarda hücre düzeyinde araştırmaların gerçekleştirilebilmesi, birçok hastalığın moleküler mekanizmasını ortaya çıkarma, anlama ve tedavi yöntemlerinin geliştirilebilmesine moleküler tekniklerin kullanımı önemli bir yer tutmaktadır. Dolayısı ile biyokimya alanında ihtisas yapan herkesin bu teknikleri öğrenmesi gereklidir.

Türk Biyokimya Derneği (TBD) ile Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı’nın ortak çalışmalarıyla bu yıl TBD Akademi altında ilki düzenlenen “Araştırmada ve Tıbbi Uygulamada Kullanılan Moleküler Laboratuvar Teknikleri: Uygulamalı Eğitim Kursu” başlıklı eğitim 10-14 Eylül 2018 tarihleri arasında Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Prof. Dr. Aylin Sepici Dinçel’in ev sahipliğinde gerçekleştirildi. Lisansüstü düzeyi kapsayan bu kursa Yakın Doğu Üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı araştırma görevlisi ve Biyokimya.Vet ekip üyesi olan Veteriner Hekim Sevgi Gençosman’da katılarak moleküler teknikler alanında bilgi ve beceri kazanmak adına önemli bir adım attı.

Kursun genel kapsamı temel moleküler teknikler olup bunlar arasında DNA/RNA izolasyonu, elektoforez tekniği ve kullanım alanları, PCR kullanım alanları ve uygulaması, Western Blot tekniği, primer ve prop tasarımı ile veri analizleri hakkında eğitim gerçekleştirilmiştir. Bu teknikler hem teorik hem de uygulamaları olarak anlatılmıştır.

Eğitim kursu sonunda temel moleküler teknikler ve kullanım alanları hakkında bir bakış açısı kazanan Sevgi Gençosman hem YDÜ Veteriner Fakültesi’ni hem de Biyokimya.Vet’i Ankara’da bu beş günlük süreçte temsil etmiş ve eksiksiz katılımıyla eğitim sonunda sertifika almaya hak kazanmıştır.

22. ESDAR Konferansı İspanya’da düzenlendi.

Yirmi ikincisi düzenlenen ESDAR (European Society for Domestic Animal Reproduction) konferansı bu sene 27-29 Eylül 2018 tarihleri arasında İspanya’da University of Cordoba’nın ev sahipliğinde gerçekleştirildi.

Klinik yaklaşımlar, biyoteknolojik gelişmeler ve reprodüksiyon fizyolojisi alanında eğitim ve araştırmayı teşvik etmek amacıyla faaliyet gösteren ESDAR 1996 yılında kurulmuştur. Kurulduğu yıldan itibaren her sene farklı ülkelerde konferanslar düzenleyerek bilimsel bilginin paylaşılması ve tartışılması sağlanmaktadır. Konferans ayrıca Web of Science tarafından yayınlanan Conference Proceedings Citation Index’de taranması ile ayrıca önemli bir yere sahiptir.

Biyokimya.Vet editörü ve YDÜ Veteriner Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı öğretim üyesi Yrd. Doç. Dr. Serkan SAYINER’ inde araştırıcı olarak yer aldığı ve YDÜ Veteriner Fakültesi Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı öğretim üyeleri Prof. Dr. Selim Aslan, Yrd. Doç. Dr. Osman Ergene ve Yrd. Doç. Dr. İsfendiyar Darbaz ile birlikte çalıştıkları bir projeden hazırlanan “Accuracy Of Pregnancy Specific Blood or Milk Tests For Late Embryonic Mortality Diagnosis in Dairy Cattle” isimli bildiri poster sunumu şeklinde Yrd. Doç. Dr. İsfendiyar DARBAZ tarafından konferansta sunulmuştur. Çalışma ile süt ineklerinde embriyonik ölümlerin süt ve serumda ölçülebilen gebelik spesifik proteinler ile teşhisi konusu irdelenmiş ve elde edilen bulgular aktarılarak tartışılmıştır.

Kongreye ait diğer bilgilere http://www.esdar.org/esdar-conference-2018/announcement-2018-gb-1.html adresinden erişebiliriz.

Köpeklerde karaciğer hastalıklarının laboratuvar tanısında yeni bir belirteç: miR-122

miR-122

Karaciğer hastalıkları, köpeklerde yaygın olarak görülmektedir ve önemli bir mortalite nedenidir. Bu nedenle teşhis ve özellikle erken teşhis oldukça önemlidir.

Günümüzde karaciğer hastalıklarının tanısı amacıyla laboratuvar testlerinden yardım alınmaktadır. Ancak bu testlerin birçoğunun duyarlılığı ve spesifitesinin yüksek olmadığı da bilinmektedir. Bu durum sonuçlar ve şüpheli klinik vaka arasında ilişki kurulmasını zorlaştırılmaktadır. Dolayısı ile araştırıcıların daha duyarlı ve spesifik yeni bir belirteç arayışları devam etmektedir. İşte bunlardan biri de son zamanlarda dikkati çeken mikroRNA-122 (miR-122)’ dir.

MikroRNAlar 18-28 nükleotidden oluşan, protein kodlamayan küçük RNA molekülleridir. Kan dolaşımda bulunan çeşitli tipleri vardır ve bunlar organ spesifitesi göstermektedir. İnsanlarda 940 tipi tanımlanmıştır. Protein ekspresyonunda düzenleyici rolleri olduğu bilinmektedir. Miktar ölçümleri PCR tekniği ile yapılabilmektedir. Özellikle miR-122 tipi hepatositlerde yüksek oranda bulunmaktadır ve toplam mikroRNA’ların %70’ini oluşturmaktadır 1. Dolayısı ile karaciğer spesifik olarak kabul edilmektedir ve ilk kez doku spesifik olarak tanımlanan miRNA’dır 2.

Primat ve deney hayvanlarında yapılan çeşitli çalışmalar olmasına rağmen köpeklerde kısıtlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bunlardan dikkati çeken biri de Oosthuyzen ve ark.nın (2018) yaptığı çalışmadır 3. Çalışmada sağlıklı, karaciğer hastalığı ve karaciğer dışı hastalığı olan köpeklerin serum örneklerinden miR-122 konsantrasyonları ve rutinde altın parametre olarak kullanılan ALT enzim aktiviteleri ölçülerek karşılaştırma yapıldı. Araştırıcılar elde ettikleri bulguları değerlendirdiğinde sağlıklı köpekler ile karaciğer-dışı hastalığı olan köpekler arasında anlamlı bir fark bulmadı. Bunun yanında karaciğer hastalığı olan köpeklerde ise miR-122 ve ALT seviyelerinin daha yüksek olduğu, paralellik gösterdiği ve karaciğer hastalığının yüksek doğrulukla tanımlanabildiğini tespit ettiler. Ayrıca, sağlıklı köpekler için kan dolaşımındaki miR-122 için referans aralığını da belirlediler.

Çalışma sonucunda, miR-122’nin köpeklerde karaciğer hastalığı için potansiyel bir tarama aracı olarak kullanılabileceği ve spesifik tanıda umut verici bir adım olduğu belirtildi. Ayrıca MiR-122’nin, ALT enzim aktivitesinin referans aralıklarında olduğu zaman karaciğer hastalığını doğru bir şekilde tespit edip edemeyeceğinin kesin olarak belirlenmesi gerekliliği ve daha fazla yapılacak çalışmalar ile karaciğer hastalığı şüphesi olan köpeklerin tanısal değerlendirme ve tedavi yolunda değerli bir araç olabileceği vurgulandı.

Kaynaklar
1-Tanase CP, Ogrezeanu I, Badiu C. MicroRNAs. Mol Pathol Pituit Adenomas. 2012:91-96. doi:10.1016/B978-0-12-415830-6.00008-1
2-Jopling CL. Liver-specific microRNA-122. RNA Biol. 2012;9(2):137-142. doi:10.4161/rna.18827
3-Oosthuyzen W, Ten Berg PWL, Francis B, et al. Sensitivity and specificity of microRNA-122 for liver disease in dogs. J Vet Intern Med. 2018;(May):1-8. doi:10.1111/jvim.15250

Total kalsiyum (tCa), İyonize kalsiyum (iCa), Düzeltilmiş total kalsiyum (ctCa): Hangisi?

Kalsiyum (Ca), hem hayvan hem insan metabolizmasında çok büyük önemi olan makro elementlerden biridir.

Total kalsiyum (tCa) metabolizmasının düzenlenmesinde başlıca doku düzeyinde deri, karaciğer, böbrekler, kemikler ve bağırsaklar; molekül düzeyinde Paratiroit Hormon (PTH), Kalsitonin (CT) ve vitamin D görev alır. Kalsiyum iskelet sisteminin yapısal bileşeni olup organizmada farklı ve çeşitli görevleri vardır. Bunlar arasında kasların kontraksiyonu, kanın koagülasyonu, enzim aktivitesi, sinirsel uyarımlar, hormon salınımı, ikincil mesajcı ve membran permeabilitesi yer alır 1.

Vücuttaki hücre dışı sıvının kalsiyum iyon konsantrasyonu hayati önem taşımakta ve her zaman bir denge halinde tutulmaktadır. Bu dengenin sağlamasında birincil olarak Paratiroit hormon (PTH), Kalsitonin (CT) ve Vitamin D katkıda görev alır. Bunların dışında adrenal kortikosteroidler, östrojenler, tiroksin, somatotropin ve glukagon gibi diğer hormonlar da katkıda bulunmaktadır 1.

Plazma veya serumdaki kalsiyum 3 fraksiyona ayrılır 1,2. Bunlar:

  1. İyonize veya serbest kalsiyum (iCa veya Ca++) (≈%56)
  2. Proteinlere bağlı kalsiyum (çoğunlukla albümin) (≈%34)
  3. Kompleks veya şelat kalsiyum (küçük moleküler ağırlıklı çeşitli anyonlara bağlı taşınanlar-fosfat, bikarbonat, sitrat, laktat) (≈%10)

iCa ve kompleksleştirilmiş kalsiyum, kalsiyumun dağılabilir fraksiyonunu oluşturur. Bu kısım, biyolojik membranlardan geçtiği için ultrafiltratlanabilir kalsiyum olarak da adlandırılabilir. iCa, serum kalsiyumun fizyolojik olarak en aktif fraksiyonudur. iCa, kemik homeostazında, sinir iletimlerinde, kanın pıhtılaşmasında, Vitamin D ve PTH salgılanmasında, metabolik ve sindirim enzimlerinin aktifleştirilmesinde ve demirin etkin kullanımı gibi fonksiyonlardan sorumludur aynı zamanda patolojik durumların hassas belirtecidir 1,2.

Protein-bağlı kalsiyumun yaklaşık %90’ı albüminle bağlantılıdır ve geri kalan %10’u çeşitli globülinlere bağlıdır. Kalsiyumun yaklaşık yarısı proteinlere bağlı olduğundan tCa’un değerlendirilmesi serum albümin ve total protein değerlerine bağlıdır (Şekil 1) 3,4.

Ca

Şekil 1. iCa normalde çok dar bir aralıkta kalırken, tCa konsantrasyonu bağlı veya kompleks olan kalsiyumdan etkilenir. Diğer bir ifade ile tCa konsantrasyonu, proteinlere bağlı Ca veya kompleks Ca fraksiyonlarındaki değişime bağlı olarak farklılık gösterebilir 3.

Geleneksel olarak, bir hayvanın kalsiyum durumunun değerlendirilmesi, tCa konsantrasyonunun değerlendirilmesine dayanmaktadır. tCa konsantrasyonunun, kalsiyum durumunun belirlenmesi için biyolojik olarak aktif fraksiyon ve altın standardı olan iCa ile doğru orantılı olduğu varsayılmaktadır. Buna rağmen bu varsayımın çeşitli klinik durumlarda geçerliliği yoktur. iCa ölçümünün mümkün olmadığı durumlarda özellikle hipoalbüminemi veya hipoproteinemisi olan hastalarda, diyagnostik yorumu iyileştirmek adına tCa’nın albümin veya total protein konsantrasyonuna göre düzeltilebileceği veya ayarlanabileceği öne sürülmüktedir. Ayrıca pH’daki değişiklikler, albümine bağlı olan kalsiyum fraksiyonunu değiştirir; bu nedenle, iCa konsantrasyonu, tCa’da değişim olmadan da değişebilir. İşte bu düzeltilen veya ayarlanabilen tCa’ya düzeltilmiş kalsiyum (ctCa) denir. Özellikle plazma albümin konsantrasyonun değiştiği durumlarda ctCa’nın değerlendirilmesi önerilir. Bugüne kadar, iCa ve ctCa konsantrasyonlarını belirlemek için çeşitli denklemler önerilmektedir (Tablo 1) 1,5,6.

Tablo 1. Albümin ve total protein konsantrasyonu üzerinden iCa ve ctCa hesaplanmasında kullanılan çeşitli denklemler.

tCa, albümin ve total proteinin konsantrasyon ölçümü in-house ve laboratuvar tipi analitik cihazlar ile kolaylıkla yapılabilmektedir. Genellikle bu tip cihazlarda sırası ile Arsenazo III, Bromkresol yeşili ve Biüret yöntemleri kullanılır.

epociCa konsantrasyonun ölçümü ise ion-seçici elektrodları (ISE) olan cihazlar ile yapılmaktadır. Bu tip cihazlar mobil veya bench tipi POC (point-of-care) cihazlar (Şekil 2) olabileceği gibi otomatik biyokimya analizörlerinin bir bileşenide olabilir. Mobil tipi cihazlar kliniklerde sıklıkla tercih edilmektedir ve genellikle yüksek maliyetli olup elde edilen sonuçların referans laboratuvar sonuçları ile karşılaştırılması önerilmektedir; şüpheli durumlarda veya zaman zaman kalite kontrol amaçlı bu işlem önerilmektedir 2.

iCa konsantrasyonu ölçüleceği zaman örneğin toplanması ve işlenmesi azami dikkat ve titizlikle yapılmalıdır. Örnekler anaerobik ortamda toplanmalı (karbondioksit kaybını en aza indirgemek için), soğuk zincirde taşınmalı ve birkaç saat içinde işlenmelidir (laktat üretimini en aza indirgemek için). tCa konsantrasyonu ölçümleri, nispeten ucuz, kolaylıkla temin edilebilir ve örnek taşıma değişkenlerine karşı daha dayanıklıdır. Bu sebeplerle günümüzde sıklıkla total kalsiyumun ölçümü yapılmakta ve değerlendirilmektedir.

Sonuç olarak, vücut Ca dengesinin izlenmesinde her üç parametreninde kullanılabileceği bildirilmektedir. Bu noktadaki en önemli husus her bir parametrenin ne olduğunu, değişkenlerini ve yanıltıcı olabilecek hususları anlamaktadır. Özellikle hipoalbuminemik vakalarda Ca durumunun bir göstergesi olarak tCa’nın kullanılması hipokalseminin fazla tahmin edilmesine ve normokalseminin göz ardı edilmesine; ctCa kullanılması normokalseminin fazla tahmin edilmesine ve hipokalseminin göz ardı edilmesine neden olabilir. Bu nedenle hipoalbüminemik vakalarda Ca homeostazisi, tCa veya ctCa yerine iCa konsantrasyonları ile değerlendirilmesi önerilmektedir. Böylece gerçek bir hipokalseminin olup olmadığı belirlenebilir.

Yazıyı PDF formatında indirmek için tıklayınız.

Kaynaklar
1-Caprita R, Caprita A, Cretescu I. Estimation of Ionized Calcium and Corrected Total Calcium Concentration Based on Serum Albumin Level. Anim Sci Biotechnol. 2013;46(1):180-184.
2-Danner J, Ridgway MD, Rubin SI, Le Boedec K. Development of a Multivariate Predictive Model to Estimate Ionized Calcium Concentration from Serum Biochemical Profile Results in Dogs. J Vet Intern Med. 2017;31(5):1392-1402. doi:10.1111/jvim.14800

3-Bohn AA. Veterinary Hematology and Clinical Biochemistry. 2nd ed. (Thrall MA, Weiser G, Allison R, Campbell T, eds.). NJ, US: Wiley-Blackwell, John Wiley & Sons; 2012.

4-Payne RB, Carver ME, Morgan DB. Interpretation of serum total calcium: effects of adjustment of albumin concentration on frequency of abnormal values and on detection of change in the individual. J Clin Pathol. 1979;32(1):56-60. doi:10.1136/jcp.32.1.56

5-Sharp CR, Kerl ME, Mann FA. A comparison of total calcium, corrected calcium, and ionized calcium concentrations as indicators of calcium homeostasis among hypoalbuminemic dogs requiring intensive care: Original study. J Vet Emerg Crit Care. 2009;19(6):571-578. doi:10.1111/j.1476-4431.2009.00485.x

6-Toffaletti JG. September 2011 Clinical Laboratory News : Calcium. 2011;37(9):6-10.